Modifikation und Analyse von Genen

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Grundlagen der molekularbiologischen Genmanipulation

cDNA-Herstellung

Die Herstellung von cDNA (komplementäre DNA) ist ein faszinierender Prozess, bei dem eine DNA-Kopie von einer mRNA-Vorlage, also einer gereiften und prozessierten mRNA, erzeugt wird. Dies geschieht ohne direkte Beteiligung der ursprünglichen DNA des Organismus.

Ein Primer, der spezifisch an die RNA bindet, wird zusammen mit der Reverse Transkriptase verwendet, einem Enzym, das RNA in DNA umschreibt. Hier kommen die dNTPs (deoxyribonucleotide triphosphates) ins Spiel, die als Bausteine dienen und von der Reverse Transkriptase verwendet werden, um den neuen DNA-Strang zu synthetisieren.

Wichtiges Werkzeug

Die Reverse Transkriptase ist besonders relevant für die Forschung und Diagnostik, denn sie ermöglicht es, aus RNA, die Informationen über Genexpression trägt, stabile DNA zu gewinnen, welche dann leichter analysierbar ist.

Gel-Elektrophorese zur Analyse von DNA-Fragmenten

Die Gel-Elektrophorese ist eine essenzielle Methode zur Analyse von DNA-Fragmenten. Bei dieser Technik werden DNA-Moleküle durch ein Gel geleitet, das entweder aus Agarose oder Polyacrylamid besteht, abhängig von der Größe der DNA-Fragmente, die analysiert werden sollen. Größere Fragmente werden typischerweise in einem Agarosegel, kleinere in Polyacrylamidgel analysiert.

DNA-Banden einer Gelelektrophorese unter UV-Licht im durch Ethidiumbromid gefärbten Agarose-Gel.1

Unter elektrophoretischen Bedingungen wandern die DNA-Fragmente aufgrund ihrer negativen Ladung zur Anode. Die unterschiedliche Wanderungsgeschwindigkeit der Fragmente je nach ihrer Länge ermöglicht es, sie zu separieren und so eine Größenbestimmung durchzuführen.

DNA-Ligasen und Restriktionsenzyme

DNA-Ligasen sind entscheidend in Prozessen der DNA-Replikation und -Reparatur. Sie formen Esterbindungen zwischen den DNA-Strängen, was besonders bei der Verbindung der Okazaki-Fragmente auf dem verzögerten Strang während der DNA-Replikation wichtig ist.

In der Gentechnik werden DNA-Ligasen genutzt, um rekombinante DNA-Segmente in Vektoren einzubauen. Diese Vektoren können dann in Wirtsorganismen eingebracht werden, um dort das gewünschte Gen zu exprimieren.

Restriktionsenzyme sind biologische “Schneidewerkzeuge”, die DNA an spezifischen Erkennungssequenzen schneiden. Die resultierenden Fragmente können entweder sticky ends oder blunt ends haben. Sticky ends haben überstehende Einzelstränge, welche das Zusammenfügen von DNA-Fragmenten erleichtern.

Besonders gefragt beim IMPP

Das IMPP fragt besonders gerne nach der Anwendung und den Unterschieden zwischen sticky ends und blunt ends, sowie deren Rolle bei der Klonierung und genetischen Rekombination.

Durch die Kombination von Restriktionsenzymen und DNA-Ligasen können Wissenschaftler gezielt DNA modifizieren und rekombinante DNA für weiterführende Experimente oder therapeutische Zwecke erstellen.

Zusammenfassung

  • cDNA-Herstellung: Ein Prozess, bei welchem Reverse Transkriptase RNA in DNA umschreibt. Diese Methode ist nützlich, um Genexpression durch RNA zu untersuchen, indem sie in stabile DNA umgewandelt wird, die einfacher zu analysieren ist.
  • Gel-Elektrophorese: Eine Methode zur Größenbestimmung von DNA-Fragmenten, indem diese unter Elektrophorese durch ein Gel (Agarose oder Polyacrylamid) migrieren. Die Wanderungsgeschwindigkeit wird durch die Länge der DNA-Fragmente bestimmt, was eine Trennung ermöglicht.
  • DNA-Ligasen: Enzyme, die Esterbindungen zwischen DNA-Strängen formen, essentiell für DNA-Replikation und -Reparatur. Sie werden in der Gentechnik verwendet, um rekombinante DNA in Vektoren einzubauen, die dann in Wirtsorganismen eingebracht werden.
  • Restriktionsenzyme: Biologische ‘Schneidewerkzeuge’, die DNA an spezifischen Stellen schneiden und entweder sticky ends oder blunt ends erzeugen. Diese Fragmente sind grundlegend für DNA-Klonierungs- und Rekombinationstechniken.
  • Wichtigkeit der Reverse Transkriptase: Diese ist besonders bedeutsam für Forschung und Diagnostik, weil sie es ermöglicht, aus RNA (die Genexpression widerspiegelt) stabile DNA zu gewinnen und so die Analyse von Gentranskripten vereinfacht.

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Footnotes

  1. Credits DNA-Banden einer Gelelektrophorese unter UV-Licht im durch Ethidiumbromid gefärbten Agarose-Gel. Grafik: Mnolf, Gel electrophoresis 2, CC BY-SA 3.0↩︎