Messmethodik

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Einführung in die elektroanalytischen Verfahren mit einem Fokus auf die Elektrophorese

Kapillarelektrophorese (KE)

Bei der Kapillarelektrophorese werden Lösungen geladener Moleküle durch eine dünne Kapillare gepumpt, die ein elektrisches Feld trägt. Diese Kapillaren haben typischerweise Innendurchmesser von 50 - 75 Mikrometern und eine Länge, die deutlich über 125 mm liegt. Die Bewegung der Moleküle wird durch zwei Hauptkräfte beeinflusst:

  • Elektroosmotischer Fluss (EOF): Dies ist die Bewegung der Flüssigkeit in der Kapillare, die die geladenen Moleküle unabhängig von ihrer Ladung mitführt.
  • Elektrophoretische Mobilität: Die Bewegung geladener Moleküle durch das elektrische Feld hin zur Elektrode mit entgegengesetzter Ladung.
Wichtig beim pH-Wert der Elektrolytlösung

Der pH-Wert der Elektrolytlösung ist entscheidend, da er die Ladung der Moleküle und somit ihre Wanderungsrichtung und -geschwindigkeit beeinflusst.

Gelelektrophorese

Im Gegensatz zur Kapillarelektrophorese nutzt die Gelelektrophorese ein Gel als Medium, um Moleküle zu trennen. Dies ist besonders nützlich für die Trennung von DNA, RNA und Proteinen. Die Größe der Poren im Gel bestimmt, welche Molekülgrößen durchgelassen werden.

Detektionsmethoden

UV-Detektoren in der MEKC

UV-Detektoren sind für die Messung in der Micellar Electrokinetic Chromatography (MEKC) geeignet, wobei die Wellenlänge so gewählt werden muss, dass die Tenside der Mizellen die Messung nicht beeinflussen. Dies ermöglicht die Detektion der Moleküle während ihrer Migration durch die Kapillare.

Färbetechniken in der Gelelektrophorese

Für die Detektion von Proteinen werden spezielle Farbstoffe wie Coomassie-Brillant-Blau verwendet. Diese binden an die basischen funktionellen Gruppen der Aminosäuren, was eine visuelle Detektion ermöglicht. Hierbei ist die Unterscheidung zwischen nativen und denaturierten Proteinen besonders interessant, da diese unterschiedliche Wanderungsstrecken aufweisen.

Injektionsverfahren und Polung der Spannung

Das Injektionsverfahren umfasst den Einsatz von Kieselglaskapillaren und Boratpuffern. Dabei ist die korrekte Polung der Spannung essentiell, um die gewünschte Migrationsrichtung und -geschwindigkeit der Moleküle zu gewährleisten. Geladene Moleküle migrieren zur Elektrode mit entgegengesetzter Ladung, wobei der EOF alle Moleküle unabhängig von ihrer Ladung mitführt.

Isoelektrische Fokussierung

Die isoelektrische Fokussierung ist eine spezielle Form der Elektrophorese, bei der Proteine an ihrem isoelektrischen Punkt (dem pH-Wert, bei dem das Protein keine Nettoladung hat) konzentriert werden. Dies wird genutzt, um den isoelektrischen Punkt von Proteinen zu bestimmen, wobei der Mittelwert der pKS-Werte der Aminosäuren verwendet wird.

Zusammenfassung

  • Kapillarelektrophorese ermöglicht die Trennung von Molekülen in einer Quarzglaskapillare unter Einsatz eines elektrischen Feldes, wobei die Detektion der Analyten an der Kathodenseite erfolgt.
  • Elektroosmotischer Fluss (EOF) und das Verhältnis von Ladung zu hydrodynamischem Radius sind entscheidend für die Analyse und Trennung der Moleküle.
  • Detektionsmethoden: UV-Detektoren sind geeignet, solange die Wellenlänge so gewählt wird, dass die Messung nicht durch Tenside der Mizellen beeinträchtigt wird; die Positionierung der Detektion hängt von der Ladung der Moleküle und pH-Bedingungen ab.
  • Kapillareigenschaften: Typische Innendurchmesser der für MEKC und Kapillarelektrophorese verwendeten Kapillaren liegen zwischen 50 - 75 Mikrometern, und ihre Länge überschreitet oft 125 mm.
  • Einflussfaktoren auf EOF: Die Viskosität der Pufferlösung beeinflusst den elektroosmotischen Fluss signifikant, mit der Faustregel, dass eine erhöhte Viskosität den Fluss verringert.
  • Proteindetektion in der Gelelektrophorese: Farbstoffe wie Coomassie-Brillant-Blau binden an basische Gruppen von Aminosäuren in Proteinen, was für die Quantifizierung der Proteinmenge genutzt wird.

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